通用型无缝克隆试剂盒
| 货号 | AO4104 |
| 规格 | 件 |
| 品名 | 通用型无缝克隆试剂盒 |
| 库存 | 有货（999 件） |
AO4104 通用型无缝克隆试剂盒
开泰生物 | 高品质科研试剂
| 货号 | AO4104 |
| 品名 | 通用型无缝克隆试剂盒 |
| 规格 | 100 rxn |
产品介绍
常见问题解答 Q1：引物如何设计？ A1:引物由三部分组成：同源臂（15-25 bp，不计算酶切位点和残留碱基，GC含量40%-65%）+酶切位点（按需保留或舍弃）+特异性引物（引物Tm值由特异性序列决定，计算Tm值不包括同源臂和酶切位点的序列）。 Q2: 平板上长不出克隆或克隆数目少 A2: 2.1 引物设计不正确：即同源臂序列选择不合适，应避免选择含有高级结构的同源序列。同源臂的大小应为15-25 bp（不包括酶切位点），且GC含量应在40%-65%。同源臂的长度小于13 bp或者大于35 bp时，重组效率低。 2.2 载体和外源DNA纯度较低：酶切或PCR扩增获得的载体/外源DNA片段应胶回收纯化，纯化的DNA应直接溶解于ddH 2 O中。 2.3 载体和外源DNA的摩尔比不佳：使用更精准的方法进行外源DNA和载体的定量（用Nanodrop的方法或琼脂糖凝胶电泳的方法进行定量）。 2.4 感受态转化效率低：使用高效感受态（10 8 CFU/μg以上），并将转化产物全部涂平板。 2.5 平板配置错误：选择错误的抗生素或在固体LB培养基中加入了过量抗生素。涂板时检查载体的抗性并选择正确的抗生素和浓度。 2.6 设置阳性对照：用于排查是否因操作原因、感受态效率下降、试剂酶活力下降而导致的重组效率低。 2.7 实验反应条件：建议水浴或PCR仪控温，温度不准会导致重组效率下降。 2.8 反应体系不合适：建议10 μL反应体系，若直接使用酶切产物或PCR产物进行重组反应时，添加的体积之和不能超过重组反应总体积的1/5，否则会降低重组效率。 2.9 转化体积过量：重组产物的转化体积不应该超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率。 Q3：阳性对照不长克隆或长得很少 A3： 3.1 抗性使用错误。 3.2 感受态转化效率低：确保感受态转化效率＞10 7 cfu/μg，即将1 ng质粒转化至100 μL感受态细胞中，取1/10进行涂板，生长1000个菌斑，估算感受态转化效率为10 7 cfu/μg； Q4：假阳性/空载体/测序无信号 A4: 4.1 载体线性化处理不完全：通过阴性对照检测载体是否线性化完全，如果阴性对照长了很多克隆，可能是模板加入量过多或线性化处理不完全，可优化酶切体系，提高限制内切酶使用量并延长酶切反应时间；或者更换效率更高的限制性内切酶；胶回收酶切产物。回收产物溶解于ddH 2 O中。 4.2 环型质粒模板残留导致假阳性：使用Dpn I除去含有甲基化修饰的环型质粒模板，模板投入量不宜过多(<1 ng)，否则可能导致Dpn I消化不完全从而造成假阳性；胶回收酶切产物。回收产物溶解于ddH 2 O中。 4.3 连入非目的片段：PCR扩增获得外源DNA片段时，产生非特异片段，建议胶回收PCR产物，回收产物溶解于ddH 2 O中。 Q5：大多数克隆含有不正确片段 A5: 5.1 PCR扩增外源片段不特异：优化PCR扩增体系，提高特异性；胶回收PCR产物；重新设计引物；挑取更多的克隆鉴定。 5.2 反应体系中混入相同抗性的质粒：PCR扩增模板为环状质粒时，扩增产物应进行Dpn I处理或胶回收纯化。 5.3 反应体系中混入了其它序列：进一步纯化PCR产物，排除PCR产物不纯等因素造成的影响；使用干净的耗材，ddH 2 O等，避免试剂或耗材带来的污染。 5.4 测序样本数太少：需要多挑几个样本测序。 Q6：菌落或菌液PCR无条带 A6: 6.1 PCR体系或程序不合适：用载体引物进行菌落PCR鉴定时，没有目的条带也没有空载体条带，则说明PCR体系
